As forças espanholas lideradas por Pedro de Alvarado conquistaram os reinos maias das terras altas da Guatemala a partir de 1524, expandindo o domínio espanhol para o sul após a queda do Império Asteca. Em 1527, a Coroa criou a Capitania Geral da Guatemala, uma divisão administrativa do Vice-Reino da Nova Espanha que chegou a incluir o território das atuais Guatemala, El Salvador, Honduras, Nicarágua, Costa Rica e Chiapas. A primeira capital colonial, Ciudad Vieja, foi destruída por um deslizamento de terra em 1541, o que forçou as autoridades espanholas a mudarem a sede do governo.
Em 1543, a capital foi restabelecida em Santiago de Guatemala, hoje conhecida como Antigua Guatemala, que serviu por quase dois séculos como o centro político, religioso e cultural da Capitania Geral. A sociedade colonial espanhola era organizada em torno dos sistemas de trabalho encomienda e, mais tarde, repartimiento, que obrigavam as comunidades indígenas a trabalhar para os proprietários de terras espanhóis e para a igreja, enquanto missionários católicos buscavam converter a população em massa. O período colonial da Guatemala mudou bastante após uma série de terremotos em 1773 que destruíram Antigua, levando a Coroa a mudar a capital novamente, desta vez para o local da atual Cidade da Guatemala, em 1776.
A economia do período colonial da Guatemala dependia muito da exportação de corante de anil e cochonilha, um corante vermelho feito de insetos, produzidos principalmente por meio de mão de obra indígena e de africanos escravizados. A Capitania Geral da Guatemala permaneceu sob domínio espanhol até a América Central declarar sua independência em 1821, formalizada na Ata de Independência da América Central. Depois disso, a Guatemala fez parte brevemente do Império Mexicano antes de se tornar parte da República Federal da América Central.
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