Las fuerzas españolas al mando de Pedro de Alvarado conquistaron los reinos mayas del altiplano guatemalteco a partir de 1524, extendiendo el control español hacia el sur desde el recién sometido Imperio azteca. En 1527, la Corona estableció la Capitanía General de Guatemala, una división administrativa del Virreinato de Nueva España que con el tiempo llegó a abarcar el territorio de lo que hoy es Guatemala, El Salvador, Honduras, Nicaragua, Costa Rica y Chiapas. La primera capital colonial, Ciudad Vieja, fue destruida por un deslave catastrófico en 1541, lo que obligó a las autoridades españolas a trasladar la sede del gobierno.
En 1543, la capital se restableció en Santiago de Guatemala, hoy conocida como Antigua Guatemala, la cual sirvió durante casi dos siglos como el centro político, religioso y cultural de la Capitanía General. La sociedad colonial española se organizó en torno a los sistemas de trabajo de encomienda y, más tarde, de repartimiento, que obligaban a las comunidades indígenas a trabajar para los terratenientes españoles y la iglesia, mientras los misioneros católicos llevaban a cabo intensas labores de conversión. El periodo colonial de Guatemala se vio transformado por una serie de terremotos en 1773 que dañaron gravemente Antigua, lo que llevó a la Corona a trasladar la capital nuevamente, esta vez al sitio de la actual Ciudad de Guatemala en 1776.
La economía del periodo colonial en Guatemala dependía en gran medida de la exportación de tinte de añil y cochinilla, un tinte rojo a base de insectos, producido principalmente mediante mano de obra indígena y africana esclavizada. La Capitanía General de Guatemala permaneció bajo dominio español hasta que Centroamérica declaró su independencia en 1821, formalizada en el Acta de Independencia de Centroamérica, tras lo cual Guatemala se unió brevemente al efímero Imperio mexicano antes de formar parte de la República Federal de Centroamérica.
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