Las expediciones españolas que buscaban una ruta hacia la plata andina llegaron al río Paraguay en la década de 1530. En 1537, los hombres de Domingo Martínez de Irala fundaron un fuerte en Asunción que se convirtió en la base para la colonización española de la región. Al encontrar poco oro, los colonos estrecharon lazos con los guaraníes y se casaron con ellos; la población mestiza resultante definió el idioma y las costumbres de la colonia durante siglos. Desde Asunción, Irala extendió la autoridad española hacia el este, hasta el río Paraná, y organizó el territorio circundante, mientras una línea de fuertes fronterizos frenaba la expansión portuguesa desde Brasil.
Durante gran parte de los siglos XVII y XVIII, los misioneros jesuitas administraron una red de unas treinta reducciones en las cuencas de los ríos Paraná y Uruguay. Estas comunidades combinaban la conversión religiosa con la agricultura, la producción artesanal y la defensa contra los traficantes de esclavos de São Paulo. Las misiones operaban con una autonomía inusual frente a las autoridades coloniales de Asunción, lo que generó resentimiento entre los terratenientes españoles que querían acceder a la mano de obra guaraní. Esa fricción, sumada a las reformas borbónicas, llevó a la corona española a expulsar a los jesuitas de sus territorios en 1767, tras lo cual los asentamientos misionales fueron abandonados y quedaron en ruinas.
El estatus de la colonia cambió de nuevo en 1776, cuando España creó el Virreinato del Río de la Plata y puso a Asunción bajo la autoridad de la nueva capital virreinal en Buenos Aires. Este cambio disminuyó la importancia que la región tenía antes como centro del poder español y profundizó el resentimiento local por el control de Buenos Aires, quejas que saldrían a la luz unas décadas más tarde cuando los paraguayos empezaron a exigir su propio derecho al autogobierno.
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