As forças espanholas, expandindo-se a partir de sua base no Peru, avançaram pelas terras altas dos Andes durante a década de 1530. Nessa região, que chamaram de Alto Peru, encontraram comunidades que antes faziam parte do Império Inca. Conquistadores como Diego de Almagro estabeleceram as primeiras reivindicações espanholas, e administradores coloniais logo fundaram assentamentos permanentes: La Plata, sede da influente Audiência de Charcas, foi estabelecida em 1538, seguida por La Paz em 1548.
A descoberta de enormes depósitos de prata em Potosí, em 1545, transformou a região de um posto avançado periférico no território mais rico do Império Espanhol. Milhares de garimpeiros e trabalhadores correram para a montanha conhecida como Cerro Rico, e Potosí cresceu rapidamente, tornando-se uma das maiores cidades das Américas. A produção mineira dependia muito do trabalho indígena forçado sob o sistema de mita, que obrigava as comunidades andinas a trabalhar em condições perigosas por longos períodos.
O Alto Peru permaneceu sob o Vice-Reino do Peru durante a maior parte da era colonial, antes de ser transferido para o recém-criado Vice-Reino do Rio da Prata em 1776. Proprietários de terras e administradores de ascendência espanhola formaram uma elite colonial dominante, enquanto grande parte da população indígena foi reduzida à agricultura de subsistência e a obrigações trabalhistas. A região tornou-se um campo de batalha disputado durante as guerras de independência do início do século XIX, e a república da Bolívia, nomeada em homenagem a Simón Bolívar, foi formalmente estabelecida em 1825.
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